今日热点如何用蛋白定量检测试剂盒检测IL-8及cAMP的含2022/7/22 12:51:00

2022-7-22 12:51| 发布者: msmkmm2012| 查看: 10| 评论: 0

摘要: 　　如何用蛋白定量检测试剂盒检测IL-8及cAMP的含量　　背景　　SPARCLEIA为一种全新的均相检测试剂盒，原理基于闪光型化学发光技术并且需任何固相载体，也需分开孵育抗体或对微孔板进行清洗，可以在60分钟内完成全 ...

　　如何用蛋白定量检测试剂盒检测IL-8及cAMP的含量

　　背景

　　SPARCLEIA为一种全新的均相检测试剂盒，原理基于闪光型化学发光技术并且需任何固相载体，也需分开孵育抗体或对微孔板进行清洗，可以在60分钟内完成全部检测过程。SpatialProximityAnalyteReagentCaptureLuminescence(SPARCL)是一种距离依赖型化学发光检测技术，可用于两个特异性结合分子之间的相互作用的检测或研究两个配体之间关系。SPARCL检测(图一)，一种配体分子上标记了化学发光底物化学发光底物，另外一种配体分子上标记了辣根过氧化物酶(HRP)，两种分子由于特异性结合作用彼此相互靠近，在背景还原剂（BackgroundReducingAgent)的环境中当SPARCL标记分子与HRP标记分子距离足够近时，当加入触发溶液后(TriggerSolution)就会产生光学信号。

　　势

　　仅需孵育一步，可在60分钟内完成检测；

　　均相免洗型试验、节省清洗液用量，降低成本；

　　标记的抗体或蛋白需进行纯化，节省了时间；

　　灵活的试验方式、可广泛应用于针对不同靶标物的检测

　　酶标仪使用SPARCL技术可大大减少检测步骤，同时也可保证结果的灵敏度和动态学范围，非常适合高通量检测的应用。试剂盒模拟机体内自然环境，消除内在可变因素的影响，如连接固相支持物的过程，具有检测速度更、检测结果的精确度更高等特点。因为仅仅需要一步孵育过程，大大简化了操作的流程，SPARCLEIA检测方法适应多种检测应用的要求，包括ELISA检测、蛋白质之间相互作用的检测、蛋白质与核酸之间相互作用的检测和高通量结合试验等(图二)。

　　LPS刺激THP-1细胞表达IL-8的检测

　　反应体系中脂多糖(LPS)刺激细胞后产生IL-8，使用SPARCLEIA试剂盒的“明治”法检测光学信号变化来反映出IL-8浓度的变化。THP-1以1百万细胞每毫升的密度在37度条件下孵育培养四个小时，LPS以1mg/ml起始浓度下作梯度稀释。不同浓度的样品与标记有SPARCL和辣根过氧化物酶(HRP)的抗IL-8的抗体一起孵育一小时后，在每孔内加入背景还原剂(BackgroundReducingAgent)，然后将微孔板放入SpectraMax L化学发光型微孔板读板机内读数。每孔内加入触发溶液(TriggerSolution)后1秒钟内检测产生光学信号(图)。

　　脂多糖(LPS)刺激THP-1细胞表达IL-8的浓度效应学曲线，在96孔板中，使用SPARCLEIA试剂盒进行检测。SoftMaxPro软件直接绘制出曲线并计算曲线下RLU面积值，获得EC50=7.3ng/mL以及在EC80=0.93的Z值。

　　SPARCLEIA竞争法检测cAMP的含量

　　SPARCLEIA检测试剂盒可用“竞争法”来检测cAMP的含量(图四)。cAMP的抗体标记了SPARCL后，将其和标记有辣根过氧化物酶(HRP)的cAMP和含有cAMP的样品一起加入含有DPBS+0.1%BSA缓冲溶液中，在白色384孔板中孵育60分钟，然后加入SPARCL背景还原剂，比较后将准备好的微孔板放入带有注器的微孔板读板机中自动加入触发溶液(TriggerSolution)发光。在竞争反应过程中，标记有HRP的cAMP和样品中含有的cAMP与标记有SPARCL的cAMP抗体发生竞争性结合。如图五所示，样品中cAMP越高浓度，其发光信号值越低。

　　SPARCLEIA竞争法检测cAMP含量生成的标准曲线，在白色384孔板中，将标记有的化学发光底物(SPARCLreagent)的cAMP抗体和连接有辣根过氧化物酶(HRP)的cAMP及样品中含有的cAMP一起在含有DPBS+0.1%BSA的环境下进行孵育60分钟。RLU结果取决于SpectraMaxL化学发光型读板机对每孔收集一秒信号后生成曲线下部

　　结论

　　这里我们看到SPARCLEIA试剂盒，即可用于“明治”法检测也可用于竞争法检测。两种检测都可在均相环境下进行，不需要分开孵育、封闭和清洗等步骤，即节省时间又降低成本。SPARCLEIA试剂盒是一种速、均相、灵活的检测平台，可应用于包括ELISA检测、蛋白质之间相互作用检测、蛋白质与核酸之间相互作用检测等高通量结合试验。

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