分析贴壁细胞消化传代中常见问题的解答2023/7/13 17:13:45

2023-7-13 17:13| 发布者: msmkmm2012| 查看: 59| 评论: 0

摘要: 贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选 ...

贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。介绍一种简单的消化传代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30），弃之，再加入适量胰酶作用10-40（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。1、洗去血清2、加15VPBSD-H，2到3次3、110V胰酶4、镜下观察，见突起缩回（细胞间隙增大）即加含血清培液5、吹打后（加培液）6、分种轮廓仪的相关知识也可以到网站具体了解一下，有专业的客服人员为您全面解读，相信会有一个好的合作！http://ahyunpao.com/

对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。1、弃去旧培养液，PBS或D液清洗2－3遍（除去旧培养液中血清的影响）；2、加入0125%(025%也可以)胰酶6滴（252的培养瓶），使胰酶刚刚可以布满整个底；3、作用1左右,用含10%血清的培养液3-5中和；4、轻柔吹打细胞脱壁,离心。赞同不用PBS也不用H洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。对付难消化细胞的做法是弃取培养液后，用004%的EDTA冲洗一次，再用14的004%的EDTA室温孵育5，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积110。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好。EDTA对细胞有损伤作用，一般在难消化的细胞才和胰酶合用，用了EDTA后把细胞离心后洗几遍洗去EDTA。首先，EDTA对细胞肯定有伤害，EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合，致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。但是，这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下，还不致对细胞产生过大影响。其H的胰酶中就有EDTA。因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。如果EDTA对细胞的伤害不是可逆的，想象一下，过去重金属中时用EDTA解岂不是又喝了一种药！
培养的BASMC：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲一下，倒掉，再加入0125-025%胰酶约6-10滴或1（25）消化，再加入适量新培养基中和，并分瓶这种方法简单、省事；效果很好并且不损失细胞！
问题1：我的细胞消化要用EDTA加胰酶消化20分钟，有什么好办法解答1：先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的025%的胰酶加入3左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很就下来了，还不需要吹打，分散也均匀
问题2：消化细胞后都用什么洗涤呀带血清的PBS，还是直接用PBS，或者是用培养液呀我原代培养的细胞二次接种后总是有些细胞铺不开，有些又铺很好，不知是什么问题，求教一下解答2：不管是进口血清或是国产血清，都用PBS直接冲洗次即可，没有必要用DMEM或加血清的培养液。见意你查查胰酶消化的原理，本论坛中就有，加了血清胰酶怎么消化呀。
细胞铺不开，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。养MSC，传代时候胰酶消化过后，用加血清的培养液终止消化，再离心。弃上清夜，再加入含血清培养液，重悬浮细胞，吹打均匀，计数，安所需密度接种。先用少量培养液，比如1到2，润湿培养瓶，然后再接种细胞原因是如果直接接种细胞的话，肯定有的地方接触了较多培养液，而有的地方几乎就没有培养液，细胞当然不会在没有营养的地方待着了。总之，先用少量培养液润湿应该是一个解决办法。我们的观点为：1、不洗的细胞传代后，次日一般要换液一次，除去没有贴壁的死细胞．如果是悬浮生长的细胞则不用处理。2、用离心洗涤来出去残留胰酶是不必要的，增加污染机会，也造成细胞丢失，还会使些一些细胞死亡。
问题3：以前一直养悬浮细胞，现在养贴壁细胞，总感觉消化时间老是把握不好，有时候消化过头了，损失很多细胞；有时又消化不充分，导致吹打时候困难，恳请各位给予指点！解答3：消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。消化时间不应超过5分钟，否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷细胞，当细胞收缩，部分细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上细胞。应该没问题。消化的时间不能一概而伦，要看你的细胞的种类，即使同一种细胞，在不同的细胞株也回出现消化的时间不同的现象，象我们验室以前的VERO细胞就很好消化，一般就是2-3分钟左右，现在重新拿了一株新的VERO细胞平均每次消化在5分钟以上；其次要看你配的胰酶的质量，如果配的比较好，消化的时候就要好消化一点，反之就久一点。还要在你看到消化过头的情况下，如果细胞下来的比较多了，这时你把CMF或PBS连同细胞弃去是很浪费的，你还不如就连同CMF或PBS加上营养液一起传，因为营养液中有血清，胰酶一遇到血清就会自动终止消化，当然这样对你的细胞是有一定的影响的，但是这也是补救的仅有方法，我消化过头的时候都是这样处理的，只要你的血清质量够好，细胞一般都会张的较好。
问题4：本人用胰酶冷消化细胞后，终止消化后，发现絮状的组织细胞怎么也吹不散，都不容易移入培养瓶。是为什么呢解答4：我们验室使用胰酶消化细胞时胰酶并不预热，而是直接从4摄氏度冰箱中取出在室温中直接使用，对消化效果影响不大。不过我想可能有几个原因：其一：细胞生长过度，也就是在有限的空间里面细胞数量太多，相同时间内消化进行不彻底，导致大量细胞间连接没有破坏掉。其二：消化时间不够。其：楼上所说的情况我还没有经历过，可能也存在吧。不过我想应该取决于楼主用胰酶消化的细胞的性质。在培养人前列腺癌细胞PC-3M时也遇到过类似问题。当时是准备做流式，看药物对细胞周期和调亡的影响。首先排除了药物对细胞的影响，后来发现可能是由于细胞属高度转移的细胞系，贴壁不牢，常规消化会破坏细胞膜，出现非常难吹散的白色絮状物。于是尝试了以下两种方法：1、加入消化液使其扑满瓶底后迅速将其倒出，缩短消化时间。2、不使用消化液，用培养液直接将贴壁细胞吹打下来。此法会造成细胞丢失，但完全避免了消化液消化过度的影响，在细胞量较大时可尝试。此外，还在文献上看到常规消化后，加入含血清的PBS洗细胞，终止残存消化液的作用，我没有亲自尝试过。其冷消化和热消化都所谓，当然一般热消化会比冷消化要好一点，因为胰酶在加热时活性高一些，这取决于你的细胞．出现絮状物可能是你的细胞破碎后DNA释放造成，你可以试用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇见过类似情况，加ＤＮａｓｅ就没有了．当然也可能是其它原因，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用浓度一般２０－３０ｕ／ｍｌ，你可以在配胰酶时直接加到胰酶中．
问题5：我培养的是卵巢癌患者腹水中提取的原代肿瘤细胞，现在已经铺满瓶底。今晚消化传代时，发现用胰酶后消化15分钟，也只有少部分细胞变圆飘起，大部分细胞稍有皱缩，但是贴壁还是很劳。吹打也掉不下来。我的胰酶是3－28配的，配好后一直放在4度冰箱。是不是胰酶失效了还是原代细胞就是难消化
回答5：胰酶配好分装后，置－20度备用，使用之前37水浴溶解，252的培养瓶用2的胰酶，所以分装时，尽量考虑到每次的用量，一次拿出来就用完。避免胰酶反复冻融超，易失效。胰酶消化时，要在37度培养箱内，一般025％胰酶2～3分钟，005％胰酶－EDTA3～5分钟，贴壁细胞即可完全飘起。象你这种情况，估计是胰酶失效，3月28到今天4月17日，你只是把胰酶放在4度保存，时间和温度都不合适。也有一种可能性：生长状态不好的细胞，消化时间也会延长。但我们还没有消化超过5分钟还不能的情况。

(来源：丁香论坛